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WB-上样与SDS-PAGE凝胶电泳

1.蛋白上样缓冲液的选择

 

蛋白样品准备后,需要混合加入蛋白上样缓冲液,主要具有指示和沉降作用,以方便随时观察电泳进度和将携带的样本沉降至凝胶底部。

(D)蛋白上样缓冲液主要成分

主要成分

主要功能

SDS

使所有蛋白质带负电荷,使蛋白变性

β-巯基乙醇或DTT

减少二硫键的形成

溴酚蓝

离子型染料,可观察蛋白迁移

甘油

增加样品密度,起沉降作用

一般情况下都可对蛋白样品进行还原和变性处理。但是也存在一些特殊实验的要求。例如有些抗体仅识别非还原形式蛋白,或者识别的抗原表位在抗原的天然构型中由非临近氨基酸组成,因此针对这些情况的蛋白样品处理,我们要选择不含有使蛋白质还原变性成分的上样缓冲液。

 

上样缓冲液产品推荐

产品货号

产品名称

产品规格

用途

7722S

Blue Loading Buffer Pack

1包

上样缓冲液

abs953

2*上样缓冲液

10 ml

上样缓冲液

B-125

5X Loading Buffer

1ml

上样缓冲液

 

2.凝胶电泳技术

在印迹之前分离复杂蛋白混合物常用方法是一维(1-D)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),其根据蛋白质分子量进行分离。在一些特殊情况下,需要天然非变性的目的蛋白,则需要使用非变性电泳进行分离。除了常用的1-D凝胶电泳,二维(2-D)凝胶电泳是分析细胞类型、组织和体液中蛋白组成的理想技术,也是蛋白组学的核心技术。 

 

3.凝胶的准备

进行凝胶电泳之前,需要凝胶的准备。可选择不同浓度(丙烯酰胺所占百分比)和不同厚度的凝胶。通常凝胶厚度为1.0和1.5 mm,对于印迹而言,较薄的凝胶(=1 mm)的蛋白转移最好,大分子量蛋白的转移时,较薄凝胶转印效果优于较厚凝胶;凝胶的浓度(丙烯酰胺所占百分比)选择主要由目的蛋白的分子量所决定,若分析未知蛋白或更广泛的分离,建议使用梯度浓度胶。

 

除了在凝胶的厚度和浓度上的选择,我们还需注意先前准备蛋白样品是否为变性还原样品,从而再次确定凝胶中的成分使用,选择使用变性或非变性的电泳分离蛋白。

 

产品货号

产品名称

产品规格

用途

abs47014877

RIPA Lysis Buffer (Strong)

100 ml

裂解样品

abs47014881

NP-40 Lysis Buffer

100 ml

裂解样品

abs47014880

Lysis Buffer for WB/IP Assays

100 ml

裂解样品(非变性)

abs47014932

Red Blood Cell Lysis Buffer

100/250/500 ml

裂解组织或血液样品并去除红细胞

 

确定所需凝胶后,凝胶可购买现成商业预制胶,或自行配置


在自行配置凝胶时,完整组装制胶器防止漏胶;避免加入气泡;压胶时缓慢均匀加入压胶液(无水乙醇、异丙醇或纯水都可);浓缩胶与分离胶之间适宜的分配比例;制造泳道插入或拔出泳梳时,保持泳梳的垂直上下,避免产生气泡;注意凝胶时间和温度,凝胶时间不宜过长,可于4℃保存。

(E)凝胶配置成分

凝胶成分

主要作用

聚丙烯酰胺

为蛋白质电泳提供载体,其凝固程度直接关系到电泳结果

Tris-HCl

制胶缓冲液

过硫酸铵(APS)

催化凝胶凝固

SDS

破坏蛋白质二、三级结构

TEMED

催化APS作用从而促使凝胶凝固

 

4.凝胶电泳缓冲液

最常用的凝胶电泳缓冲液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine组成的,缓冲液中通常含有0.1%去污剂SDS。Tris甘氨酸缓冲液系统适合分离分子量范围广(6-200 kDa)的蛋白,并与变性或非变性条件兼容。Tris-tricine系统最适合分离较小的、需要在上样之前还原和变性的蛋白(<10 kDa)。两种缓冲液系统都与蛋白转移至膜上兼容。Tris醋酸缓冲液有时用于较大的蛋白分离。


进行凝胶电泳实验,上样缓冲液、凝胶和电泳缓冲液的选择都会涉及到样品蛋白的状态,从而进行选择使用。

(F)凝胶电泳条件与蛋白状态关系

蛋白状态

凝胶条件

上样缓冲液

电泳缓冲液

还原-变性

还原&变性

β-巯基乙醇或DTT,有SDS

有SDS

还原-天然

还原&不变性

β-巯基乙醇或DTT,无SDS

无SDS

氧化-变性

非还原&变性

无β-巯基乙醇或DTT,有 SDS

有SDS

氧化-天然

非还原&不变性

无β-巯基乙醇或DTT,无 SDS

无SDS

 

凝胶电泳产品推荐

产品货号

产品名称

产品规格

用途

80-6418-77

GE蛋白电泳仪

1台

凝胶电泳

abs9301~abs9313

预制胶

1盒

凝胶电泳

abs951

10*电泳液

100 ml/1 L

凝胶电泳

 

5.分子量标准

于样品蛋白旁的分子量标准,有助于估计分离后目的蛋白大小。目前市面上主要有两种类型标准品。未染和预染marker,其中未染marker需要借助染色步骤才可观察它们于凝胶或膜上定位。而预染marker可在电泳过程中实时监控凝胶上的蛋白分离以及后续转印至膜上的效果,但是蛋白上结合的染料会改变印迹过程中蛋白吸附至膜上的能力,因而会存在一定的不准确性。

 

蛋白marker产品推荐

货号

产品名称

产品规格

用途

abs923

Prestained Protein Ladder/marker

500 μl

分子量标准

 

6.阳性对照和内参的使用

实验中加入阳性对照,以表明实验的有效性和准确性,提高实验可信度。
内参是用来检测凝胶中的泳道是否载有相同的上样量,在比较不同样品的蛋白表达水平时,加入内参尤其重要,对检查整改凝胶的平均转膜也十分重要。因此,加入内参对照对实验是十分必要的。

(G)不同内参的使用

内参

样品类型

分子量(kDa)

注意事项

β肌动蛋白

全细胞/细胞质

43

不适用于骨骼肌样品,细胞生长条件的改变和细胞外基质成分的相互作用可能会改变肌动蛋白的合成

GAPDH

全细胞/细胞质

30-40

一些生理因素会增强GAPDH在特定细胞中的表达

微管蛋白

全细胞/细胞质

55

微管蛋白的表达会随抗菌和抗有丝分裂抗性药物而改变

VDCA1/膜孔蛋白

线粒体

31

 

COXIV

线粒体

16

会有许多蛋白像COXIV出现在16 kDa的位置

核纤层蛋白B1

细胞核

66

不适合核膜被除去的样本

TATA结合蛋白TBP

细胞核

38

不适合DNA被除去的样本

 

内参对照产品推荐

货号

产品名称

产品规格

用途

2904S

VEGF Receptor 2 Control Proteins

150 μl

实验对照

abs830030-32

GAPDH、actin、β-tubulin

50/100 μl

实验对照

 

7.凝胶电泳的启动

跑胶时所使用电流和时间,主要按照厂家推荐时间进行,可随不同仪器的改变而改变。同时结合具体实验需求、目的蛋白大小等,进行适当调整。
当样品到达至凝胶底部时,结束跑胶,此时蛋白会从凝胶上逐渐被洗脱掉,因此要尽快进行接下来的转印操作实验。

 

8.蛋白凝胶染色

蛋白在凝胶上的显色阶段,可帮助我们知道蛋白印迹的迁移水平,验证蛋白是否转移至膜上。凝胶电泳后,分离开来的蛋白若需要转膜,则应使用可逆染料(如丽春红、铜染法等);若无需转膜时,则可使用不可逆染料(如考马斯亮蓝等)进行染色。一般来说,可逆类染料灵敏度一般不及不可逆染料。

 

凝胶蛋白染色产品推荐

货号

产品名称

产品规格

用途

abs964/5

考马斯亮蓝染色试剂盒

1盒

蛋白染色

abs42155925

Ponceau S solution(丽春红染料)

1 L

蛋白染色

 

上海优宁维生物科技股份有限公司

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